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外泌體提取和鑒定
外泌體是指包含了復雜 RNA 和蛋白質的小膜泡（30 - 150 nm），現今，其特指直徑在40 – 100 nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現， 1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。
所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究。外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創診斷的開發。
1）提取方法
① 超速離心法：超速離心法是外泌體提取中最早建立并使用的一種方法。這種方法原理就是通過外泌體與其他細胞器的沉降系數不同，將細胞、細胞碎片以及其他細胞器等，分離出去，從而得到純凈的外泌體。
② 密度梯度離心法：這是一種普通超速離心法與密度梯度離心法結合的方法。由于外泌體的密度范圍是1.13 g/ml-1.21 g/ml，可以使用梯度介質去除非囊泡顆粒。最開始使用的梯度介質為蔗糖，所以又稱蔗糖密度梯度超速離心，在后來經過方法的不斷改進，可以使用碘克沙醇作為新的一種高效介質。相比于普通的超速離心法，它可以通過使用蔗糖等介質更好的去除樣品中大的蛋白質集體等雜質，從而得到更加純凈的外泌體。
③ 聚合物沉降法：這種方法是通過高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改變外泌體的溶解性和分散性，使其能夠在比較低的離心力下沉降出來。其原理可能與競爭性結合游離水分子和PEG本身形成的網狀結構有關。這種方法的優點就是操作起來比較簡單，不需要超速離心機，得到的外泌體數量較多，也適合大劑量的樣品處理。
④ 超濾法：這種方法是將溶劑及小分子物質過濾到膜的另一側，而將相對大分子物質截留在超濾膜上，以達到分離的目的。外泌體直徑范圍40～200 nm，我們用超濾膜經過長時間的低速離心就可以分離樣本中的外泌體。
2）外泌體鑒定
① 透射電鏡：雙層囊膜結構是外泌體重要標志之一，但普通光學顯微鏡難以觀察到此種亞顯微結構。而透射電子顯微鏡 (Transmission electron microscope，TEM) 分辨率可達0.1 ~ 0.2 nm，可將被觀察物體放大至數百萬倍，非常適合進行外泌體雙層囊膜超微結構觀測。
② 納米顆粒示蹤：透射電鏡觀察能夠確認外泌體的形態學特征，但無法體現樣本中所有外泌體顆粒的粒徑分布情況及整體濃度；流式細胞儀可測定的粒徑大小為150 nm以上，并不適合檢測游離的外泌體顆粒。Nanosight平臺的納米顆粒追蹤分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）技術，快速、精準地分析外泌體粒徑分布濃度，為外泌體存在提供有力證據。
③ Western blot：Western blot是通過抗原抗體特異性結合的原理，對外泌體標志蛋白進行檢測，從蛋白質層面對外泌體進行鑒定。常用的外泌體標志蛋白包括CD81、CD63、TSG101及Alix等。
④ PKH染色：外泌體標記檢測親脂性染料：PKH-67（Green）/PKH-26（Red），染料可以穩定的與細胞膜脂質區結合并發出熒光，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究以及體內外的細胞失蹤研究。
